人工進化が生んだ超高親和性RNA–タンパク質ペアの構造基盤解明

宮崎大学 テニュアトラック推進室　福永 圭佑 准教授（前東京科学大学特任助教）、九州大学 大学院農学研究院　寺本 岳大 助教、同角田 佳充 教授、沖縄科学技術大学院大学 核酸化学・工学ユニット　横林 洋平 教授、東京科学大学 地球生命研究所　松浦 友亮 教授らは、X線結晶構造解析の手法を用いて二つの人工RNA−タンパク質複合体（RNP）の結合様式の違いを解明することに成功しました。さらに、これらRNPを活用した高性能リボスイッチ（遺伝子発現制御用のRNAスイッチ）の開発を行い、無細胞タンパク質合成系（セルフリーシステム）（注１）においてその性能の高さを実証しました。この研究成果は、2025年3月23日にOxford University PressのオープンアクセスジャーナルNucleic Acids Researchに掲載されました。

• X線共結晶構造解析により二つの人工RNPの結合様式の違いを原子レベルで解明
• タンパク質リガンドの結合によって翻訳がONになるセルフリーシステム用リボスイッチを開発
• γ−ヘモリシンの機能発現を制御する論理回路（AND回路）を構築

CS1−LS4およびCS2−LS12は PD-SELEX法（注２）を使った実験室での共進化実験により同定された超高親和性・直交性（注３）のRNA−タンパク質（RBP）ペアです。CS1−LS4、およびCS2−LS12複合体のX線結晶構造解析を行ったところ、これらRNA−RBPペアはユニークな分子認識機構を獲得していたことが明らかとなりました。また、CS1-LS4およびCS2-LS12を分子パーツとして利用し、無細胞タンパク質合成系において翻訳制御が可能なセルフリーリボスイッチを2種類開発しました。このリボスイッチはLS4／LS12が結合することにより翻訳がONになる仕組みで、従来のセルフリーリボスイッチと比較してON/OFF比が大幅に向上していることが特徴です。さらに、リボスイッチを2つ組み合わせることで二成分系の膜タンパク質γヘモリシンの機能発現制御を行うことにも成功しました。

（注１）無細胞タンパク質合成系（セルフリーシステム）
転写に必要なRNAポリメラーゼや翻訳に必要なリボソームなどタンパク質合成に必要な成分を含む反応液であり、DNA／mRNAを追加するだけでタンパク質が合成される。近年、セルフリーシステムを用いた無細胞合成生物学研究が盛んに行われている。

（注２）PD-SELEX法
ファージディスプレイライブラリー × RNAライブラリーのセレクションを行う共進化分子工学の手法。タンパク質を提示するファージライブラリーとRNAライブラリーを構築し、試験管内で結合するRNA−RBPペアのみを選択・増幅するという操作を繰り返すことが特徴。下記の論文に詳細が掲載されています。
雑誌名：Nucleic Acids Research（2021年7月5日 オンライン公開）
論文タイトル：Directed evolution of orthogonal RNA–RBP pairs through library-vs-library in vitro selection
著者：Keisuke Fukunaga, Yohei Yokobayashi*
DOI：10.1093/nar/gkab527

（注３）直交性
高い結合選択性、また排他性があること。

雑誌名：Nucleic Acids Research（2025年3月23日 オンライン公開）
論文タイトル：Structural insights into lab-coevolved RNA–RBP pairs and applications of synthetic riboswitches in cell-free system
著者：Keisuke Fukunaga*,#, Takamasa Teramoto#, Momoka Nakashima, Toshitaka Ohtani, Riku Katsuki, Tomoaki Matsuura, Yohei Yokobayashi*, Yoshimitsu Kakuta*
#contributed equally, *corresponding authors
DOI：10.1093/nar/gkaf212

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農学研究院　寺本 岳大 助教
農学研究院　角田 佳充 教授